番茄的心室数是影响果实大小、形状和畸形果发生的重要因素(李天来等, 1996)，而畸形果严重影响了番茄的外观和品质，给番茄生产者带来严重的经济损失，因此番茄心室形成的研究对减少畸形果的发生及农业生产上具重要意义。本研究认为番茄心室数符合加性-显性模型，以加性效应为主，属不完全显性(李悦等, 2007)，同时按Castle-Wright法估算最少基因数目，估算结果为K=1.34，即控制心室数的最少主基因数目约是1对。近年来，有关番茄心室形成的分子水平研究取得了重要进展，Cong等(2008)克隆了调控番茄心室形成的重要基因fasYABBY-like转录因子。Cong等(2008)研究认为fas基因的编码区在多心室番茄和少心室番茄品系中无差异，但fas基因转录水平在不同品系中差异较大，并认为在多心室番茄中fas基因表达降低是由于在fas基因第一内含子内的6~8 kb插入突变造成的。Huang和van der Knaap (2011)研究发现，在多心室番茄中fas位点的突变是由于fas基因第一内含子处294 kb片段的倒位变异破坏了YABBY基因的结构，使突变型材料(多心室材料)中fas基因不表达。另外，Muños等(2011)将调控番茄心室形成的lc位点精细定位到第二条染色体上的一段非编码区，发现在lc位点的2个SNP与番茄心室数目有密切关系，但不编码的lc位点是如何调控心室形成的尚不明确，需要进一步的试验验证。

本课题组在番茄心室形成生理和遗传方面进行了一系列研究，特别是筛选出的性状表现稳定的高代自交系—多心室番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) “MLK1” (心室数15个左右)和少心室番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) “FL1” (心室数2~3个)，为研究番茄心室形成提供了有益材料。因此，利用这些材料揭示在fas位点和lc位点变异与番茄心室形成的分子机制将具有重要意义。

1结果与分析
1.1提取的番茄总RNA纯度和DNA完整性分析
利用紫外分光光度计测定提取得到的番茄总RNA OD_260/280值在1.8~2.0之间，说明提取的RNA纯度较好。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测番茄总RNA，发现两条电泳带28S rRNA和18S rRNA清晰、明亮、边缘完整，说明提取的RNA比较完整，且28S rRNA的亮度约为18S rRNA的两倍(图1)。番茄DNA经电泳检测出现明亮、单一条带，说明提取的DNA为高质量(图2)。

图1 番茄RNA电泳图 注: M: DL2000 marker; MLK1: 多心室番茄; FL1: 少心室番茄 Figure 1 The electrophoretogram of tomato RNA Note: M: DL2000 marker; MLK1: More locule number tomato; FL1: Few locule number tomato

图2 番茄DNA电泳图 注: M: DL2000 marker; MLK1: 多心室番茄; FL1: 少心室番茄 Figure 2 The electrophoretogram of tomato DNA Note: M: DL2000 marker; MLK1: More locule number tomato; FL1: Few locule number tomato

1.2多心室“MLK1”和少心室“FL1” fas位点分析
以DNA为模板，用fas-WT1、fas-WT2分别验证野生型fas位点上游及fas位点；用fas-I1、fas-I2分别验证变异型fas位点上游及fas位点。

PCR产物检测结果显示(图3)：fas-WT1、fas-WT2在少心室“FL1”中扩增出条带，且与目的条带大小一致。将产物进行测序结果显示与NCBI数据库比对，相似性分别为99.86%和99.7% (比对结果略)；同时两个引物在多心室“MLK1”中未扩增出产物。fas-I1、fas-I2在多心室“MLK1”中扩增出与目的条带大小一致的片度，测序结果显示与NCBI数据库比对相似性分别为99.75%和99.5%，而在少心室“FL1”中无扩增产物。将多心室“MLK1”和少心室“FL1”杂交获得F₁代，fas-I1、fas-I2、fas-WT1和fas-WT2在F₁中均可以扩增出目的条带。

图3 fas位点的基因组倒置突变的鉴定电泳图 注: M: DL2000 marker; 1: fas-W1在少心室fas基因上游扩增; 2: fas-W2在少心室fas位点扩增; 3: fas-W1在多心室fas位点上游扩增; 4: fas-W2在多心室fas位点扩增; 5: fas-I1在少心室fas上游扩增; 6: fas-W2在少心室fas位点扩增; 7: fas-I1在多心室fas位点上游扩增; 8: fas-I2在多心室fas位点上游扩增; 9: fas-W1在F1材料fas位点上游扩增; 10: fas-W2在F1材料fas位点扩增; 11: fas-I1在F1 fas位点上游扩增; 12: fas-I2在F1 fas位点扩增 Figure 3 The electrophoretogram of identifying fas genome inverted mutation Note: M: DL2000 marker; 1: fas-W1 used to amplify upstream of fas gene in FL1; 2: fas-W2 used to amplify fas gene loci in FL1; 3: fas-W1 used to amplify upstream of fas in MLK1; 4: fas-W2 used to amplify fas loci in MLK1; 5: fas-I1 used to amplify upstream of fas gene in FL1; 6: fas-W2 used to amplify fas gene loci in FL1; 7: fas-I1 used to amplify upstream of fas in MLK1; 8: fas-I2 used to amplify fas loci in MLK1; 9: fas-W1 used to amplify upstream of fas gene in F1; 10: fas-W2 used to amplify fas gene loci in F1; 11: fas-I1 used to amplify upstream of fas gene in F1; 12: fas-I2 used to amplify fas gene loci in F1

以上研究结果证明了少心室“FL1”番茄fas基因上游及fas位点序列与NCBI库中基因组序列一致，表明少心室“FL1”fas基因序列正常，且少心室“FL1”材料心室数为2~4个，进一步证明少心室“FL1”番茄fas基因属于野生型品系。引物fas-I1和fas-I2用来验证fas位点突变型品系，在多心室“MLK1”番茄中fas-I1和fas-I2扩增出与目的条带大小一致的片段，说明多心室“MLK1” fas位点发生了倒置突变，同时多心室“MLK1”心室数15个左右，进一步认为多心室“MLK1”品系fas位点属于突变型且心室数增多与fas位点突变有关。利用多心室“MLK1”和少心室“FL1”杂交得到F₁代，F₁代心室数介于多心室“MLK1”和少心室“FL1”之间。F₁代基因组同时具有多心室“MLK1”和少心室“FL1”的遗传信息，其基因组fas位点扩增结果显示fas-W1、fas-W2、fas-I1和fas-I2在F₁杂交种中都可以扩增出目的条带，因此F₁的扩增结果与预期的结果一致。

通过以上结果可初步推断少心室“FL1”的基因组在fas基因及其上游249 kb区段序列正常，而多心室“MLK1”在fas基因及其上游249 kb区段发生了突变且属于倒置突变，本研究的结果与Huang和van der Knaap (2011)的研究结果一致。

1.3 fas位点在多心室“MLK1”和少心室“FL1”番茄中的表达变化分析
在少心室“FL1”番茄中包含倒置位点的引物fas-ORF和位于倒置位点的引物组合(YZ2F与fasRNAi-R)分别扩增出目的片段为666 bp和437 bp (图4)，而在多心室“MLK1”中fas-ORF和引物YZ2F与fas-RNAi-R)无扩增产物产物。这一研究结果说明了在少心室“FL1”品系中可以转录出具有完整ORF的fas基因，而多心室“MLK1”品系中fas位点无完整ORF。为了进一步验证多心室“MLK1”品系fas变异位点是否转录表达，我们在倒置位点下游设计RNAi引物。结果表明在多心室“MLK1”和少心室“FL1”中都可以扩增出目的片段246 bp (图4)，但多心室“MLK1”表达量明显低于少心室“FL1”中表达量。

图4 fas在多心室和少心室番茄中的表达分析 注: M: DL2000 marker; 1: fas-ORF在多心室中扩增; 2: fas- ORF在少心室中扩增; 3: YZ2-F与RNAi-R在多心室中扩增; 4: YZ2-F与RNAi-R在少心室中扩增; 5: RNAi在多心室中扩增; 6: RNAi在少心室中扩增 Figure 4 Analysis of fas expression in MLK1 and FL1 Note: M: DL2000 marker; 1: fas-ORF used in MLK1; 2: fas-ORF used in FL1; 3: YZ2-F and RNAi-R used in MLK1; 4: YZ2-F and RNAi-R used in FL1; 5: RNAi used in MLK1; 6: RNAi used in FL1

结果说明少心室“FL1”番茄中fas转录出完整ORF的转录本；而多心室“MLK1”中检测不到具有完整ORF的转录本，但能检测到倒置位点下游的转录本。我们推测fas在多心室“MLK1”基因组发生倒置突变后转录一个比fas小的转录本或新的转录本。

1.4多心室“MLK1”和少心室“FL1” lc位点的分析
以DNA为模板，用lc-F和lc-R引物来验证lc区域共有的序列，用lc-WT来验证lc位点野生型番茄，用lc-I来验证lc位点突变型番茄。用验证lc位点共有序列引物(lc-F和lc-R)在少心室“FL1”和多心室“MLK1”中都扩增出序列，其片段大小与预期片段872 bp大小一致(图5)。验证lc位点突变型引物lc-I在多心室“MLK1”中扩增出目的条带，片段大小与预期结果一致(图5)，而在少心室“FL1”中未扩增出产物。验证lc位点野生型引物lc-WT在少心室“FL1”中扩增出与目的片段大小一致的条带(图5)，而在多心室“MLK1”无扩增产物。

图5 多心室和少心室lc位点鉴定电泳图。 注: M: DL2000 marker; 1: LC在少心室中扩增; 2: LC在多心室中扩增; 3: LC-I在少心室中扩增; 4: LC-I在多心室中扩增; 5: LC-WT在少心室中扩增; 6: LC-WT在多心室中扩增 Figure 5 The electrophoretogram of identifying lc loci in MLK1 and FL1 Note: M: DL2000 marker; 1: LC used in FL1; 2: LC used in MLK1; 3: LC-I used in FL1; 4: LC-I used in MLK1; 5: LC-WT used in FL1; 6: LC-WT used in MLK1

从以上结果可以看出，在多心室“MLK1”和少心室“FL1”中都存在lc位点872 bp，但在lc区域内两个材料却存在差异。其中验证lc位点突变型引物lc-I在多心室“MLK1”中获得目的条带533 bp，而在少心室“FL1”中无条带(图5)；同时利用验证lc位点野生型引物lc-WT在少心室“FL1”中扩增到目的条带395 bp，而在多心室“MLK1”中无产物(图5)。结果说明多心室“MLK1”材料在lc位点存在变异，属于突变品种，进而导致心室数增多，而少心室“FL1”在lc位点无突变，其lc位点属于野生型品种。

2讨论
Cong等(2008)研究认为大果型番茄中fas位点6~8 kb的插入破坏了基因的结构，且变异后fas位点仍存在表达。Huang和van der Knaap (2011)研究认为在大果型番茄中fas位点249 kb片段的倒位变异破坏了YABBY基因的结构，且变异后fas位点不表达。本研究结果认为，大果型多心室“MLK1”番茄fas位点变异属于249 kb倒位变异，这一结果与Huang和van der Knaap (2011)研究结果一致；fas位点表达结果认为变异后其仍表达且表达量降低，这一结果与Cong等(2008)研究结果一致。李悦等(2007)研究认为fas基因表达量与心室数呈负相关，即fas表达量越低，心室数越多，本研究中多心室“MLK1”中fas表达量低且心室数增多，因此本研究结果与前期实验结果相符合。

遗传研究认为调控心室数形成的lc位点作用值约12%，fas基因作用值约37%。番茄果实心室数的进化研究认为番茄基因首先在lc位点发生突变，在此基础上fas基因变异进一步增加果实心室数产生极大果。在本研究中，少心室“FL1”在lc位点及fas位点无突变，属于野生型材料；而多心室“MLK1”在lc位点及fas位点都存在变异，两个调控心室数位点的变异增加了多心室“MLK1”番茄的心室，使其成为大果型番茄品系。

本研究利用心室数差异显著的材料“MLK1”(多心室)和“FL1”(少心室)研究了调控心室形成的lc位点和fas位点的基因组差异，研究这两个重要位点的变异情况，为今后进行番茄心室数分子机理研究提供重要的信息。

3材料与方法
3.1材料
3.1.1供试材料
供试材料为沈阳农业大学经过多年培育获得的性状表现稳定的高代自交系-多心室番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)“MLK1”和少心室番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) “FL1”及其多心室和少心室杂交获得的F₁代，其中多心室番茄“MLK1”心室数为(15±4)个，果实扁圆形，浅红色；少心室番茄“FL1”心室数为(3±1)个，果实长圆形，深红色。两个亲本在心室数上差异较大，其他农艺性状相似，属于无限生长型。

3.1.2试剂
总RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、X-gal和IPTG为北京天根生化科技有限公司产品；pMD19-T Vector、dNTP、LA DNA Taq酶为宝生物工程(大连)有限公司。
 引物合成及PCR产物测序由上海Invitrogen公司完成。

3.2方法
3.2.1番茄DNA和总RNA的提取
取番茄叶片，分别用北京天根公司RNA提取试剂盒和DNA提取试剂盒提取植物总RNA和DNA。

3.2.2反转录反应
参照Takara公司M-MLV说明书进行。在12 μL的体系中RNA(约0.3 μg) 2 μL，oligo(dT)15 (10 mmol/L) 10 μL，混匀后70℃反应10 min，冰上放置2 min；再加入5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP Mix (各10 mmol/L) 1 μL，RRI 0.5 μL，RTase M-MLV (200 U/μL) 0.5 μL,水补至20 μL，42℃反应1 h，70℃反应15 min即可得到cDNA。

3.2.3 PCR引物设计与合成
如图6所示，在倒置片段249 kb的上下游分别设计引物SF1和EP1070，根据野生型番茄fas基因第一内含子处及上游249 kb处设计引物分别设计引物EP1071和EP1617表1。用fas-WT1 (SF1和EP1617)验证野生型fas基因上游序列，fas-WT2 (EP1070和EP1071)验证野生型fas位点；用fas-I1 (SF1和EP1071)验证fas位点突变型上游序列，用fas-I2 (EP1617和EP1070)验证fas位点突变型材料(图1)。
 

图6 验证fas位点引物位置图 Figure 6 The location of primers identifying fascinated loci in genome

表1 验证fas位点引物信息 Table 1 Sequence of primers identified fascinated loci

如图7所示，根据前人实验结果突变型和野生型品系lc位点都包含有共有的lc区域，因此设计lc引物(lc-F和lc-R)来扩增lc共有区域。突变型和野生型品系的lc位点存在2个SNPs差异，因此在野生型品系中的2个SNPs处设计引物lc-W，将lc-W和lc-R来验证lc位点野生型品系；在突变型品系中的2个SNPs处设计引物lc-I，将lc-I和lc-F来验证lc位点突变型品系，引物信息如表2所示。

图7 验证lc位点引物位置图 Figure 7 The location of primers identifying lc loci in genome

表2 验证lc位点引物信息 Table 2 Sequence of primers identifying lc loci

设计扩增fas基因完整ORF的引物fas-ORF (fasORF-F和fas-ORF-R)，用fas-ORF引物验证在两个材料中是否可以转录出fas基因完整ORF；在发生倒置位点处设计引物YZ2-F，用YZ2-F与RNAi-R验证fas倒置位点处至下游部分fas序列是否存在表达；在倒置片段249 kb下游设计引物fas-RNAi (fasRNAi-F和fas-RNAi-R)，用fas-RNAi验证fas未倒置的片段是否转录表3。

表3 验证fas基因表达引物 Figure 3 Sequences of primers identified fas expression

所有引物由上海生物工程技术有限公司合成。

3.2.4 PCR反应
分别用以上设计的引物以番茄DNA为模板进行PCR扩增。其20 μL反应体系为：cDNA (100 ng/μL)1 μL；LA DNA Taq聚合酶(5 U/L) 0.25 μL；dNTP (10 mmol/L) 0.4 μL；2×GC Buffer (含Mg²⁺) 10 μL；上下游引物(均为10 μmol)各1 μL；ddH₂O补至20 μL。扩增程序为：94℃预变性5 min，30个循环(94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)，72℃延伸5 min，PCR产物用1%的琼脂糖电泳分离目的条带。

3.2.5 PCR产物的回收、连接与转化
按照北京艾德莱DNA胶回收试剂盒进行片段回收，按照TaKaRa公司的说明书连接PCR产物与T载体，PCR产物2 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD-19T载体1 μL、ddH₂O 2 μL，16℃连接4 h，连接产物转化TOP10中，涂在氨苄的平板上进行蓝白斑筛选。

3.2.6筛选与鉴定重组体的
按照北京天根质粒小量抽提说明书提取质粒。以提取的质粒DNA为模板，用通用引物RV-M和M13-47为引物进行PCR反应，反应条件同上，1%的琼脂糖电泳检测。

作者贡献
刘莹和张庆波是本研究的实验设计和实验研究的执行人；刘莹和张庆波完成数据分析，论文初稿的写作；张庆波参与实验设计，试验结果分析；李天来是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由博士点基金(200801570001)资助。感谢沈阳农业大学园艺学院实验室各位老师同学的在本研究过程中的帮助。

参考文献
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Muños S., Ranc N., Botton E., Bérard A., Rolland S., Duffé P., Carretero Y., Le Paslier M.C., Delalande C., Bouzayen M., Brunel D., and Causse M., 2011, Increase in tomato locule number is controlled by two SNPs located near WUSCHEL, Plant Physiol., 156(4): 2244-2254

Li T.L., Wang P., Guo Y., Xu H., and He L.L., 1996, Comparion test of occurence of malformed fruit in different tomato varieties, Zhongguo Shucai (China Vegetables), (5): 10-14 (李天来, 王平, 郭泳, 须晖, 何莉莉, 1996, 不同番茄品种畸形果发生的比较, 中国蔬菜, (5): 10-14)

Li Y., Li T.L., and Wang D., 2007, Studies on the inheritance of locule formation in tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.), Yichuan Xuebao (Journal of Genetics and Genomics), 34(11): 1028-1036 (李悦, 李天来, 王丹, 2007, 番茄心室形成的遗传规律初探, 遗传学报, 34(11): 1028-1036)

Huang Z., and van der Knaap E., 2011, Tomato fruit weight 11.3 maps close to fasciated on the bottom of chromosome 11, Theor. Appl. Genet., 123(3): 465-474